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銘成講堂丨揭秘PCR實(shí)驗(yàn)室的“智慧基因”

時(shí)間：2024-12-03 714

PCR實(shí)驗(yàn)室

，又名基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室，是進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室場所

。PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡稱

。是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段

，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制

。它可以用于疾病的診斷和任何有DNA,RNA的地方，又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)

。

PCR實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域

。如法醫(yī)物證、艾滋病

、癌基因的檢測和診斷

、動(dòng)植物檢疫、化妝品

、食品衛(wèi)生檢測

、轉(zhuǎn)基因作物與轉(zhuǎn)基因微生物檢測等。

一

、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)規(guī)范依據(jù)

、《醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所基本標(biāo)準(zhǔn)（試行）》

2、《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》

、《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》

、《生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范》

5、《人間傳染的病原微生物名錄》等

二

、實(shí)驗(yàn)室的平面規(guī)劃設(shè)計(jì)

1. 設(shè)計(jì)原則

各區(qū)獨(dú)立

、注意方向、因地制宜

、方便工作

。

2. 平面區(qū)分

實(shí)驗(yàn)室主要包含：試劑準(zhǔn)備區(qū)

、標(biāo)本制備區(qū)

、擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)

。

各區(qū)在物理空間上必須是完全相互獨(dú)立的

，各區(qū)域無論是在空間上還是在使用中

，應(yīng)當(dāng)始終處于完全的分隔狀態(tài)

，不能有空氣的直接相通

。不論是組合式還是分散式布置的PCR實(shí)驗(yàn)室

，各功能房間均宜設(shè)置獨(dú)立緩沖間

。

為避免PCR產(chǎn)物污染

，PCR實(shí)驗(yàn)室空氣流向必須嚴(yán)格遵循單一方向進(jìn)行，即從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

。

2.1 分區(qū)的工作內(nèi)容

2.1.1.試劑準(zhǔn)備區(qū)

主要完成試劑配制

、分裝、儲(chǔ)存的工作

。試劑和用于樣品制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)

，不得經(jīng)過其他區(qū)域。并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑

。本區(qū)域的氣壓應(yīng)相對外界保持正壓

。

2.1.2.標(biāo)本制備區(qū)

本區(qū)域主要進(jìn)行的操作為樣本的保存、核酸(RNA、DNA)提取

、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測定DNA的合成

。樣本應(yīng)通過傳遞窗直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域

。

對于氣流壓力的控制

，由于在本區(qū)內(nèi)加樣操作可能產(chǎn)生氣溶膠，為避免氣溶膠擴(kuò)散出去對外界造成污染

，本區(qū)應(yīng)對外界保持負(fù)壓

。從質(zhì)量控制的角度而言，本區(qū)相對于擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)以及擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)為正壓

，以避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染

。但當(dāng)涉病原微生物時(shí)，根據(jù)《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用安全》對BSL-2實(shí)驗(yàn)室的各項(xiàng)安全要求

，此時(shí)要本區(qū)相對于擴(kuò)增區(qū)為負(fù)壓

，故涉及病原微生物操作時(shí) , 在綜合考慮質(zhì)量控制、生物安全因素的前提下

，整體上標(biāo)本制備區(qū)與擴(kuò)增區(qū)的壓力應(yīng)持平

。即均為負(fù)壓，兩個(gè)相鄰房間之間的負(fù)壓值基本相當(dāng)

。

2.1.3.擴(kuò)增區(qū)

本區(qū)功能是DNA擴(kuò)增和擴(kuò)增片段的測定

。已制備的DNA模板 (來自標(biāo)本制備區(qū)) 及反應(yīng)混合液 (來自試劑貯存和制備區(qū)) 制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。

對于氣流壓力的控制

，相對于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓

，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染

，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)

。個(gè)別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺內(nèi)進(jìn)行。

2.1.4.產(chǎn)物分析區(qū)

本區(qū)是擴(kuò)增產(chǎn)物的分析

?div id="m50uktp" class="box-center"> ？赡軙?huì)用到某些可致基因突變的有毒物質(zhì)，應(yīng)特別注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)

。對于氣流壓力的控制

，該區(qū)域是PCR實(shí)驗(yàn)的最后一步，壓力應(yīng)為最低

，相對于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)負(fù)壓

，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染

，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)

。

2.2.分區(qū)設(shè)置要求

2.2.1. PCR實(shí)驗(yàn)室原則上分為四個(gè)工作區(qū)域，各工作區(qū)域應(yīng)設(shè)緩沖間，工作區(qū)與緩沖間宜安裝連鎖裝置

。不同功能的工作區(qū)應(yīng)是分隔獨(dú)立的

，不能直通，需安裝傳遞窗傳送標(biāo)本等物品

。

2.2.2.實(shí)驗(yàn)材料等

，只能從試劑準(zhǔn)備區(qū)

、樣品制備區(qū)

、擴(kuò)增區(qū)輸送到產(chǎn)物分析區(qū)，不得逆向流動(dòng)

。

2.2.3.試劑準(zhǔn)備區(qū)

、擴(kuò)增區(qū) 、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

，空間可以相對小一些

；樣品制備區(qū)要放置生物安全柜和低溫冰箱，空間應(yīng)大一些

。

2.2.4.PCR實(shí)驗(yàn)室區(qū)域的設(shè)置并不是一成不變的 , 以下幾種情況需要說明：

(1)若樣本在擴(kuò)增之前需要粉碎處理 , 則需要增加一個(gè)區(qū)域用于樣品的粉碎

；

(2)若采用實(shí)時(shí)熒光PCR法，則擴(kuò)增區(qū)和分析區(qū)可以合并為一個(gè)區(qū)

；

(3)若采用全自動(dòng)化PCR分析儀

，則標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和分析區(qū)可以合并為一個(gè)區(qū)

。

樣品制備室.jpg

PCR排風(fēng)控制(1).jpg

三

、實(shí)驗(yàn)室的空間細(xì)部規(guī)劃設(shè)計(jì)

樣品制備室2.jpg

1.面積：實(shí)驗(yàn)室各個(gè)房間的面積并沒有嚴(yán)格要求，通常每間面積為10~20㎡

。試劑區(qū)一般為10-15㎡

，樣本制備間25-30㎡，擴(kuò)增室一般為10-15㎡

，產(chǎn)物擴(kuò)增室15-20㎡

。

2.室內(nèi)凈高：走道凈高不應(yīng)低于2.2m，設(shè)置空氣調(diào)節(jié)時(shí)

，不應(yīng)低于2.4m

，一般為2.4m—2.6m；當(dāng)不設(shè)置空氣調(diào)節(jié)時(shí)

，建議不宜低于2.7m

，一般為2.7m—2.9m

3.門、窗：門凈寬度應(yīng)為0.8—0.9m

，高度不應(yīng)小于2.10m

；由一個(gè)及以上標(biāo)準(zhǔn)單元組成的實(shí)驗(yàn)室的門洞寬度不應(yīng)小于1.2m，高度不應(yīng)小于2.1m；有特殊要求的房間的門洞尺寸應(yīng)按具體情況確定

；實(shí)驗(yàn)室的門扇應(yīng)設(shè)觀察窗

。外窗應(yīng)具有良好的密閉性及隔熱性，窗戶的面積需根據(jù)房間的尺寸來確定

。首層

、半地下室及地下室的外窗應(yīng)采取防蟲及防嚙齒動(dòng)物的措施。

4.PCR走廊：單面布房最小凈寬不應(yīng)小于1.3m

，單走道雙面布房最小凈寬不應(yīng)小于1.6m

，走廊地面有高差時(shí)，當(dāng)高差不足二級踏步時(shí)

，不得設(shè)置臺階

，應(yīng)設(shè)坡道，其坡度不宜大于1：8

。

5.緩沖間：進(jìn)深及進(jìn)深尺寸宜≥1300mm

，且不大于實(shí)驗(yàn)室面積的1/8。

6.設(shè)備間距：靠兩側(cè)墻布置的邊實(shí)驗(yàn)臺之間的凈距不應(yīng)小于1.5m

，當(dāng)靠一側(cè)墻改為布置排毒拒或?qū)嶒?yàn)儀器設(shè)備時(shí)

，其與另一側(cè)實(shí)驗(yàn)臺之間的凈距不應(yīng)小于1.8m，由一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單元組成的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室

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？績蓚?cè)墻布置的邊實(shí)驗(yàn)臺與房間中間布置的島式或半島式中央實(shí)驗(yàn)臺之間的凈距不應(yīng)小于1.5m。布置排毒拒或?qū)嶒?yàn)儀器設(shè)備時(shí)

，其與實(shí)驗(yàn)臺之間的凈距不應(yīng)小于1.8m

，實(shí)驗(yàn)臺的端部與走道墻之間的凈距不宜小于1.2m。

四

、實(shí)驗(yàn)室的安全事項(xiàng)

、實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該具有防止昆蟲和其他動(dòng)物進(jìn)入的措施。

、實(shí)驗(yàn)室門口位置設(shè)置緊急洗眼器和緊急噴淋

，以防止實(shí)驗(yàn)人員受到傷害。

、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的通訊設(shè)施應(yīng)該放置于生物安全柜對面

，與室外聯(lián)系的電話應(yīng)放置在醒目位置，并且放置在便于實(shí)驗(yàn)室人員快速拿起的位置

；實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的壓力顯示器和報(bào)警裝置都應(yīng)放置在醒目位置

。

4、生物安全柜的擺放位置不宜擺放在與出入口緊鄰的墻體上

。

、一個(gè)臨床基因擴(kuò)增PCR實(shí)驗(yàn)室保持兩個(gè)方向相反的安全出口

。

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